泡菜汁中植物乳桿菌的分離鑒定

杜志琳 尹 望 陳春艷 

(北京好實沃生物技術有限公司,北京 101399)

摘 要: 為豐富植物乳桿菌菌種來源,研究從泡菜汁中分離獲得3 株疑似植物乳桿菌的細菌,并分別對 其編號。通過形態特征、生理生化鑒定和16S rDNA 分子鑒定3 種方法鑒定分離獲得的3 株細菌,結果表明, 分離獲得的3 株菌均為植物乳桿菌,分別是植物乳桿菌HEW - Z106、植物乳桿菌HEW - Z111 和植物乳桿菌 HEW - Z117。 

關鍵詞: 泡菜汁; 植物乳桿菌; 分離鑒定

益生菌作為一種新型綠色飼料添加劑,受到各 國研究者的重視,有著良好的發展前景。益生菌是 對宿主有益的一類活性微生物,作用于人及動物體 腸道和生殖系統等,可改善宿主腸道微生態平衡, 發揮有益作用。而乳酸菌作為一類應用廣泛的益生 菌,是動物腸道中的優勢菌群,其無毒、無殘留及 無抗藥性備受關注。植物乳桿菌是一種常見于發酵 肉類、蔬菜和果汁中的乳酸菌,是人和動物腸道內 的主要菌群,呈革蘭陽性桿菌,不形成芽孢、無鞭 毛及不運動,過氧化氫酶試驗呈陰性,能夠產生細 菌素等抑菌物質,可抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌 及真菌的生長,有研究表明飼喂植物乳桿菌可顯著 地提高仔豬的飼料轉化率 ( P <0. 05) ,并對其日增 質量略有提升,還可降低料重比; 飼喂植物乳桿菌能 夠提高動物機體的免疫機能,調節腸道菌群的平衡, 從而達到抵抗感染性及過敏性疾病,確保動物健康生 長。隨著人們對植物乳桿菌的認識的深入及現代生物 技術的飛速發展,新型的植物乳桿菌將會進一步發掘, 并將廣泛應用于今后的食品、醫藥和飼料添加劑等領 域。研究通過從自制泡菜汁中分離獲得植物乳桿菌, 并鑒定分離獲得的菌株,旨在豐富植物乳桿菌菌種庫,為植物乳桿菌的研究提供菌種來源。 

1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 分離材料 自制泡菜汁作為分離菌種的材料。 1.1.2 菌種 植物乳桿菌購自中科院微生物菌種保藏中心, 作為生理生化鑒定中的模式菌株,在 MRS 培養基 上常規培養。 1.1.3 供試主要培養基和試劑 MRS 培養基,MRS + 碳酸鈣培養基,LB 培養 基等; 十二烷基硫酸鈉 ( SDS) 、三羥甲基氨基甲 烷 ( Tris) 堿和十六烷基三甲基溴化銨 ( CTAB) 等 細菌 DNA 提取的試劑為進口,16S rDNA PCR 擴展 引物 F: ( 5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3') 和 R:( 5' - TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3') 由上海 生物工程有限公司合成。dNTP、TaqDNA 聚合酶等均 購自生物工程 ( 上海) 有限公司,其他試劑均為國產 分析純試劑。 1.1.4 試驗儀器 見表1。 1.2 方法 1.2.1 植物乳桿菌的分離純化 取自制泡菜汁,用滅菌氯化鈉注射液稀釋到10 -4倍,取100 μL 涂布于 MRS + 碳酸鈣培養基平 板上,37 ℃厭氧培養 24 ~ 48 h 后,采用四分區劃 線法,挑取產生溶鈣圈且菌落形態疑似植物乳桿菌 的菌落形態的菌株,在 MRS 培養基平板上進行分 離純化培養,經24 ~48 h 培養后,挑取分離效果較 好的菌株,用接種環接種于斜面上 ( MRS) 進行純 培養,于4 ℃冰箱保存備用。

表1 主要儀器設備 


儀器                              公司 


       JA2003 型電子天平                    上海舜宇恒平科學儀器有限公司 

           PB -10 型數字酸度計                    德國賽多利斯科學儀器 ( 北 京) 有限公司

HZC -250 型恒溫振蕩培養箱                     江蘇省太倉市實驗設備廠 

LDZH -200KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器                上海申安醫療器械廠 

T -42K 型高速冷凍離心機                      德國 KONTRON 公司

       MG48 +型 PCR 儀                          杭州朗基科學儀器有限公司 

 GelDoc -It 200 型自動凝膠圖像分析系統                 Ultra -Violet ProductsLtd 公司 


1.2.2 生理生化鑒定 參照東秀珠的 《常見細菌系統鑒定手冊》和第 八版 《伯杰系統鑒定手冊》中的植物乳桿菌的生理 生化鑒定的試驗要求進行鑒定。 1.2.3 16S rDNA 分子鑒定 通過生理生化試驗初步篩選出的植物乳桿菌進 行基因組 DNA 鑒定,DNA 提取法參照姜云等的方 法,采用改良 CTAB 法提取。通過引物 F 及 R 對疑 似植物乳桿菌的16S rDNA 基因片段進行PCR 擴增, PCR 擴增體系 ( 25 μL) 及反應條件見表2,電泳 檢測 PCR 產物質量,并回收純化 PCR 產物,在中 科院微生物所測定疑似植物乳桿菌 DNA 序列。將 所得序列與 GenBank 中的 16S rDNA 序列進行 BLAST 比對,獲得相似的序列與系統發育相關的物 種,用 MEGA 4. 0 軟件構建系統發育樹進行系統發 育分析。 

表2 植物乳桿菌的 PCR 擴增體系 (25 μL) 及反應條件 


PCR 擴增體系 ( 25 μL)                       反應條件 


    引物 F     1.0μL                     94 ℃預變性 5 min 

  引物 R    1.0μL                     94 ℃變性 40 s 

  Taq DNA 聚合酶   1.5U                    53 ℃退火 1 min 

   10 × Taq buffer  2.5μL                    72 ℃延伸 1 min 30 s 

Mg2 + ( 25 mmoL/L) 1. 5 μL                      共30 個循環 

       菌株基因組 DNA 50 ng                        72 ℃溫浴 10 min  


2 結果與分析 2.1 細菌的初步分離觀察 通過 MRS +碳酸鈣培養基對泡菜汁進行細菌分 離,共獲得3 株疑似植物乳桿菌的菌株,并將這3 株 菌分別編號為 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW -Z117。以上3 株細菌在 MRS 培養基上用牙簽挑起 可形成黏液狀拉絲,革蘭陽性,無芽孢、莢膜及鞭 毛,菌體有細長彎曲桿狀,排列無序,也有對生, 兩端頓圓,棒形球桿狀。菌株的培養特征及菌體特 性見表 3。從圖 1 可見: HEW - Z117 在加鈣 MRS 培養基上,單個菌落能形成4 ~10 mm 溶鈣圈。 

表3 菌株培養特性、菌體特征及菌株菌落特征


菌落                  菌落特征                  菌體特性 


        HEW - Z106 乳白色,表面凸起,圓形, 邊緣整齊,表面光滑且濕潤     革蘭陽性,短桿狀,排列 無序

        HEW - Z111 乳白色,表面微凸起,小圓 形,邊緣整齊且光滑,濕潤      革蘭陽性,短桿狀,成對 排列

            HEW - Z117 乳白色,呈凸透鏡狀,表面隆起,圓形,邊緣整齊,濕潤,   革蘭陽性,棒球形桿狀,成對排列

                     有光澤,光滑



注: A 為 HEW - Z117 在 MRS +碳酸鈣培養基上生長的單菌落形 態,B 為其革蘭染色形態 

圖1 HEW - Z117 菌落形態及顯微形態 

2.2 生理生化鑒定結果 分離獲得的3 株細菌生理生化鑒定結果見表4, 3 株菌均可以在10 和 45 ℃下生長且氧化酶試驗為 陽性,精氨酸雙水解酶為陰性; 其他反應見表 4, 通過與植物乳桿菌模式菌株比較可初步鑒定 HEW - Z106、HEW -Z111 和 HEW -Z117 為植物乳桿菌。 

表4 分離菌的主要生理生化特征


2.3 16S rDNA 分子鑒定結果 通過 CTAB 法提取獲得菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 的基因組 DNA,然后 分別對 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117 的16S rDNA 進行 PCR 擴增,結果表明,通過 PCR 擴增獲得了菌株 HEW - A106、HEW - A111 和 HEW - A117 的 16S rDNA 片段,片段大小均在 1 500 bp左右,見圖2,對獲得的 16S rDNA PCR 產 物進行測序,獲得菌株 HEW - A106、HEW - A111 和 HEW - A117 的 16S rDNA 序列,大小分別為 1 425、1 467 和1 434 bp。用 MEGA4. 0 構建系統進 化樹,從圖 3 可見: 菌株HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117 均與植物乳桿菌聚于同一分 支,同源性均達到了99%。通過菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 的形態特征、生理生化 反應及 16S rDNA 特征,鑒定菌株 HEW - Z106、 HEW - Z111 和 HEW - Z117 均為植物乳桿菌。


注: M 為 DL2 000 ladder; 1 為植物乳桿菌模式菌株; 2 為 HEW - Z106; 3 為 HEW - Z111。

圖2 16S rDNA 基因 PCR 擴增電泳結果

圖3 植物乳桿菌和其他參考株16S rDNA 序列的系統進化樹 

3 討論 動物腸道是消化道中重要的吸收場所,也是其最大的免疫器官。腸道中存在大量的微生物菌群。 他們協同作用,防止外源病原菌突破這道屏障,以 達到維護機體健康的效果。植物乳桿菌是動物腸道 菌群的一種共生菌,能夠產生乳酸菌素,可有效抑 制消化道中的病原菌 ( 大腸桿菌和沙門菌) 的生 長,維持動物腸道的微生態平衡,從而達到防治疾 病的效果,不但解決了抗生素使用所產生的殘留問 題,而且能夠提高動物飼料轉化率。研究通過選擇 培養基從泡菜汁中分離獲得了 3 株疑似植物乳桿菌 的菌株,通過形態學鑒定、生理生化鑒定和16S rDNA 分子鑒定發現,3 株菌均為植物乳桿菌,即 HEW - Z106、HEW - Z111 和 HEW - Z117。研究獲 得的植物乳桿菌通過發酵生產并處理加工后,作為 飼料添加劑應用于動物,無害、無污染且安全。 目前,國內外對植物乳桿菌的研究已經廣泛開 展,并取得了一定的成效,歐盟及其他國家也已將 植物乳桿菌作為飼料添加劑中微生態制劑菌種的一 種。我國是植物乳桿菌等乳酸菌資源比較豐富的國 家,對其進一步研究起步較晚。近年來,植物乳桿 菌已經引起眾多研究人員對乳酸菌、益生素、食品 添加劑、飼料添加劑及新藥品開發等的研究。植物 乳桿菌不僅能夠使動物腸道環境偏酸,不利于病原 菌生長,而且能夠產生抑菌物質,抑制病原菌的侵 入。研究僅對分離獲得的菌種進行了鑒定,將對其 他益生性能做進一步研究,將深入探討這 3 株植物 乳桿菌的益生性,及其在動物微生態制劑中的應用 效果,仍需要動物飼養試驗才能確定。

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2018年6月8日 14:48
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