一株來自泡菜汁中的 酵母菌分離鑒定

杜志琳  尹望 

(北京好實沃生物技術有限公司,北京 101399)


摘 要:為豐富酵母菌菌種來源,研究從泡菜汁中分離獲得 1 株疑似酵母菌,并對其編號。通過形態特 征、生理生化鑒定和 18S rDNA 分子鑒定 3 種方法鑒定分離獲得 1 株菌。結果表明,分離獲得的菌株為畢赤 酵母 HEW - C206。

關鍵詞: 泡菜汁; 酵母菌; 分離鑒定

多年以來,人們為了保障動物健康、預防突發疾病及提高飼料利用率,將防腐劑和抗生素等應用 在動物飼料中,為畜牧業的發展做出了巨大貢獻。 但長期使用抗生素等添加劑使動物腸道微生態平衡 失衡,導致動物免疫力下降,甚至發病或死亡等, 從而嚴重制約了畜牧業的發展。目前,國際上各國 已經嚴格限制抗生素等添加劑的使用量。這就促使 人們去尋找并開發綠色無污染的飼料添加劑,于是 微生態制劑就應運而生,并慢慢發展起來了。國內 外普遍使用的微生態制劑有乳酸菌類、酵母菌類、 芽孢桿菌類及曲霉類等單一菌制劑和復合菌制劑。 酵母菌是單細胞真核微生物,是人和動物腸道 的主要菌群之一,具有繁殖快、易培養及產率高等 特性,其菌體細胞含有豐富的氨基酸、多肽、微量 元素及維生素等。大量研究表明,飼料中添加酵母 菌及其發酵物,可提高反芻動物瘤胃中的洗滌纖維 的消化率和總揮發性脂肪酸的質量濃度等。酵母及 其培養物可提高瘤胃微生物蛋白質產量,還能夠提 高奶牛干物質采食量,并增強消化能力,最終起到 提高動物生產性能的作用,不同菌株的酵母添加劑 的作用效果差異很大。酵母菌劑還可以為新生仔豬提供蛋白質,抑制病原菌的繁殖,刺激有益菌生 長,提高免疫力,減少仔豬腹瀉及死亡。酵母菌應 用于水產養殖,不僅可以提高魚的成活率,可以增 質量,增強魚苗抵抗力,還可以提高魚類對食物的 利用率。隨著人們對酵母菌研究的深入及現代生物 技術的發展,將會進一步挖掘新型的酵母菌,并廣 泛地應用于食品、飼料添加劑和生物醫藥等領域。 研究通過從自制泡菜汁中分離獲得酵母菌,并鑒定 分離獲得的菌株,旨在豐富酵母菌菌種庫,為酵母 菌的研究提供菌種來源。 

1 材料與方法 

1.1 材料

1.1.1 分離材料 自制泡菜汁作為分離菌種的材料。

1.1.2 菌種 畢赤酵母菌購自中科院微生物菌種保藏中心,作為 生理生化鑒定中的模式菌株,在PDA培養基上培養。

1.1.3 供試主要培養基和試劑 PDA 培養基,YPD + 硫酸鏈霉素培養基,YPD 培養基等; 酵母菌 18S rDNA PCR 擴展引物 EF3: ( 5' - TCCTCTAAATGACCAAGTTTG - 3 ') 和 EF4: ( 5'- GGAAGGGRTGTATTTATTAG - 3') 由上海生 物工程有限公司合成。巰基乙醇、dNTP、TaqDNA 聚合酶和酵母菌DNA提取盒等均購自生物工程

表1 主要儀器設備 

( 上海) 有限公司,其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.4 試驗儀器 主要試驗儀器見表1。 

1.2 方法 

1.2.1 酵母菌的分離純化 取自制泡菜汁,用滅菌氯化鈉注射液稀釋到 10 -4,取100 μL 涂布于 YPD + 硫酸鏈霉素培養基 平板上,28 ℃培養 24 ~ 48 h 后,采用四分區劃線 法,挑取具有典型酵母菌菌落特征的菌落在PDA 培 養基平板上進行2 ~ 3 次純化培養,經 24 - 48 h 培 養后,挑取分離效果較好的菌株,經鏡檢為純種 后,用接種環接種于斜面上 ( PDA) 進行純培養, 于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 形態特征鑒定

1.2.2.1 酵母菌菌落形態觀察 固體培養的菌落形態: 將斜面保藏的菌種接種 到 PDA 平板上,于28 ℃培養48 h,觀察菌落形狀、 大小、邊緣、顏色、質地和濕潤程度等。 液體培養的菌落形態: 將斜面保藏的菌種接種 到 PDA 液體培養基中,于28 ℃搖床震蕩培養24 h, 觀察發酵液狀態,菌液是否有渾濁現象,液面是否 有菌醭或菌島,底層是否有沉淀,培養基的顏色, 隨時記錄現象。 

1.2.2.2 酵母菌個體形態觀察 用滅菌接種環挑取 PDA 固體培養基上單菌落于 載玻片上,用滅菌氯化鈉溶液稀釋,于100 ×油鏡下 觀察細胞形態,記錄菌體形狀、假菌絲及繁殖方式。 

1.2.3 生理生化鑒定 參照巴尼特的 《酵母菌的特征與鑒定手冊》和 C P Kurtzman 等及 Kreger - van Rijetal 等的酵母分類 體系 ( 第4 版) 中的酵母菌的生理生化鑒定的試驗 要求進行鑒定。 

1.2.4 18S rDNA 分子鑒定 通過生理生化試驗初步篩選出的酵母菌進行基因

組DNA 鑒定,用酵母菌 DNA 提取試劑盒提取酵母 DNA,通過引物EF3 和EF4 對疑似酵母菌的18S rDNA 基因片段進行 PCR 擴增,PCR 擴增體系 ( 25 μL) 及反應條件見表2,電泳檢測 PCR 產物,并回收純 化 PCR 產物,在中科院微生物所測定疑似酵母菌 DNA 序列。將所得序列與 GenBank 中的 18S rDNA 序列進行 BLAST 比對,獲得相似的序列與系統發育 相關的物種,用 MEGA 5. 0 軟件構建系統發育樹進 行系統發育分析。 

表2 酵母菌的 PCR 擴增體系 (25 μL) 及反應條件 

2 結果與分析

2.1 酵母菌的初步分離 試驗取鮮艷泡菜汁,稀釋后涂布于含有硫酸鏈 霉素的YPD 培養基上,將具有酵母菌典型特征的菌 落進行了分離純化,并通過鏡檢初步確定其復合酵 母菌的細胞及形態特征,共分離純化出 2 株菌,并 分別編號為 HEW - C206 和 HEW - C107。

2.2 菌株形態及培養特征 2 株菌的液體培養特征基本相似,都未出現菌 醭和菌島,但底部均有白色絮狀沉淀物; 固體培養 時,在平板上菌落呈圓形,邊緣整齊,白色或乳白 色,不透明,直徑約 1 ~4 mm,菌落質地均勻,表 面光滑、濕潤且黏稠,易挑起,并伴有發酵香氣。 各菌株的細胞形態呈橢圓形,生殖方式是芽殖,沒 有假菌絲產生。 

2.3 生理生化鑒定結果 分離獲得的2 株細菌生理生化鑒定結果見表3。 2 株菌均可以在 10 和 45 ℃下生長,通過與酵母菌模式菌株畢赤酵母比較可初步鑒定 HEW - C206 和 HEW - C107 為酵母菌,并且菌株 HEW - C206 初步 鑒定為畢赤酵母。 

表3 分離菌的主要生理生化特征 


2.4 18S rDNA 分子鑒定結果 通過對菌株HEW -C206 的基因組DNA 進行18S rDNA PCR 擴增。結果表明: PCR 擴增獲得菌株 HEW - C206 的 18S rDNA 片段,片段大小均在 1 500 bp左右見圖1。對獲得的18S rDNA PCR 產物進 行測序,獲得菌株 HEW - C206 的 18S rDNA 序列, 大小分別為1 442 bp。用 MEGA5. 0 構建系統進化樹 見圖2??梢钥闯鼍?HEW - C206 與畢赤酵母聚于 同一分支,同源性均達到了99%。通過菌株 HEW - C206 的形態特征、生理生化反應及18S rDNA 序列分 析,確定菌株 HEW -C206 為畢赤酵母。


注: M 為 DL2000 ladder,1 為酵母菌模式菌株; 2 為 HEW - C206。 圖1 18S rDNA 基因 PCR 擴增電泳結果

圖2 酵母菌和其他參考株18S rDNA 序列的系統進化樹 


3 討論 健康的動物腸道內存在大量的正常菌群,主要 是以乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道專性厭氧菌為優勢 菌的腸道菌群,穩定的腸道群系能協助動物產生免 疫反應。腸道微生物協同作用,抑制病原微生物的 生長繁殖,同時促進腸道功能的完善。酵母菌是動 物腸道菌群的一種共生菌,可有效降低消化道中的 大腸桿菌數,并調節腸道菌群平衡。不但解決了濫 用抗生素所產生的殘留問題,還能夠促進動物飼料 的消化率。研究通過選擇培養基從泡菜汁中分離獲 得了1 株疑似酵母菌的菌株,通過形態學鑒定、生 理生化鑒定和18S rDNA 分子鑒定,發現其為畢赤酵母 菌。研究獲得的酵母菌通過發酵及后處理加工,可作 為飼料添加劑應用于動物,無毒、無污染且安全。 酵母菌作為一種綠色、安全及有效的飼料添加 劑,現已被廣泛運用到畜牧業生產中,對其研究已 經成為當今的熱點。在國外,有關酵母菌的研究報 道較多,在我國近幾年才剛剛興起,因此對酵母菌 的研究和認識還不夠,還需要進一步的深入。酵母 菌能夠為動物提供蛋白質,抑制腸道病原菌的繁 殖,刺激有益菌的生長,提高免疫力和抵抗力,減 少腹瀉及死亡。研究只是對分離獲得的菌種進行了 鑒定,將對其他益生性能做進一步研究,深入探討 這株酵母菌的益生性,并應用在動物微生態制劑 中,這需要動物飼養試驗才能確定。研究為日后新 型酵母菌飼料添加劑及酵母菌菌種的選擇等的研究 提供了基礎。

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2018年6月8日 14:44
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