豬源枯草芽孢桿菌 HEW -B113 的 鑒定及發酵工藝優化

尹望   杜志琳

(北京好實沃生物技術有限公司,北京 101399)


摘 要:研究從豬腸道中獲得一株疑似枯草芽孢桿菌,通過形態特征、生理生化鑒定和 16S rDNA 分子 鑒定確定其為枯草芽孢桿菌,并采用液體發酵法,以發酵液中活菌數和芽孢數為指標,通過單因素試驗和正 交試驗對枯草芽孢桿菌 HEW - B113 的培養基和發酵條件進行優化。確定其最佳培養基配方為玉米淀粉 2%、 葡萄糖1%、豆粉1%、硫酸錳0. 2%和硫酸鐵0. 15%; 最佳發酵條件為初始pH 7. 1、接種量0. 8%、發酵搖 瓶裝液量100 mL/500 mL、轉速200 r/min、發酵溫度35 ℃及發酵時間40 h。采用枯草芽孢桿菌的最優發酵 工藝可以降低成本,提高質量,為枯草芽孢桿菌的擴大化生產提供理論依據。 

關鍵詞:枯草芽孢桿菌; 鑒定; 發酵工藝

雖然抗生素等添加劑能夠有效預防畜禽疾病, 但抗生素的濫用引起病菌產生耐藥性、環境污染及 藥物殘留等不利影響,加之人們對食品安全的要 求,近年來,歐洲已有許多國家禁止使用抗生素作 為飼料添加劑,各國學者著力于研究抗生素的理想 替代品。微生態制劑作為一種飼料添加劑,不僅能 夠防病治病,促進動物生長,而且具有無污染、無 殘留及無抗藥性的特點,是抗生素無法比擬的???草芽胞桿菌是常用微生態制劑之一,芽孢桿菌是一 類好氧或兼性厭氧菌,可產生芽孢,能夠耐酸耐 堿、耐高溫和高壓,具有較高的穩定性。它們在動 物消化道內的繁衍及代謝,能夠產生多種維生素、 氨基酸、有機酸、蛋白質和多種有效的酶等,參與 機體的新陳代謝,有助于動物對飼料中營養物質的 消化吸收,從而促進動物生長; 同時還具有生物頡 頏功能,通過消耗腸道中的游離氧來維持腸道的厭 氧環境,可以有效抑制動物腸道有害菌的繁殖,維 持消化道菌群平衡。目前市場上已有大量枯草芽孢桿菌微生態制劑,但大部分菌株都是從諸如土壤、 水和草地等自然環境中分離獲得的。要想獲得好的 枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑,枯草芽孢桿菌必須經 過長期的進化、與動物形成共生關系及來源于動物腸 道內,才可以更好地適應動物的體內環境,從而發揮 更好的效果。研究主要從健康的豬體內分離出經過適 應豬腸道環境的枯草芽孢桿菌,并對其發酵工藝進行 優化,為微生態飼料添加劑的開發提供候選菌株。 

1 材料與方法

1.1 材料 

1.1.1 供試菌種 菌種 HEW - B113 分離篩選自豬腸道內容物, 按照常規方法在營養瓊脂 ( NA) 培養基上培養。 

1.1.2 主要試劑 細菌通用16S rDNA PCR 擴展引物27F 和1492R 由生物工程 ( 上海) 有限公司合成。TaqDNA 聚合酶 和 dNTP 購自生物工程 ( 上海) 有限公司。 

1.1.3 主要儀器 T - 42K 型高速冷凍離心機 ( 德國 KONTRON 公司) ,MG48 + 型 PCR 儀 ( 杭州朗基科學儀器有限公司) ,GelDoc - It 200 型自動凝膠圖像分析系統 ( Ultra - Violet ProductsLtd 公司) 。 1.1.4 培養基 菌落計數培養基 ( 牛肉膏蛋白胨固體培養基) : 牛肉膏 0. 3%,蛋白胨 1%,NaCl 0. 5%,瓊脂粉 2%,pH 7. 2 ~7. 4; 種子培養基 ( 牛肉膏蛋白胨液體培養基) : 牛肉 膏0. 3%,蛋白胨1%,NaCl 0. 5%,pH 7. 2 ~7. 4; 基礎發酵培養基: 葡萄糖 1%,蛋白胨 1%, MgSO4·7H2O 0. 1%,pH 7. 2 ~7. 4。 

1.2 方法

1.2.1 菌株 HEW - B113 的鑒定 菌株 HEW - B113 的初步鑒定: 將菌株 HEW - B113 劃線接種于 NA 固體平板培養基上,37 ℃恒 溫培養18 ~24 h 后,觀察記錄活性菌株的單菌落形 態,主要包括菌落形狀大小、菌落顏色、菌落水 分、菌落厚度和透明度等。革蘭染色法觀察菌株 HEW - B113 的細胞形態。將活化后的菌株 HEW - B113 接種于 LB 培養基中,37 ℃ 200 r/min 恒溫振 蕩培養12 h 后,用帶膜的銅網蘸取少量菌液,放置 90 s,用濾紙將邊緣液體吸干; 然后將帶菌的銅網 放入燒杯中用 ddH2O 漂洗,取出帶菌銅網并將液體 用濾紙吸干,再用 2%磷鎢酸處理 3 ~ 5 min,樣品 負染色完成后用電鏡觀察。 生理生化特征: 參照東秀珠的 《常見細菌系統 鑒定手冊》和第八版 《伯杰系統鑒定手冊》中的方 法進行活性菌株生理生化鑒定。 分子生物學鑒定: 菌株 HEW - B113 基因組 DNA 提取參照姜云等的方法,采用 CTAB 法提取。 利用 細 菌 16S rDNA 通 用 引 物 ( F27: 5 ' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3 ',R1492: 5 ' - TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3' ) 對菌株 HEW - B113 的16S rDNA 基因片段進行 PCR 擴增,PCR 擴 增體系 ( 25 μL) 包括引物27F 和1492R 各1. 0 μL, Taq DNA 聚合酶 1. 5 U,10 × Taqbuffer2. 5 μL, Mg2 + ( 25 mmoL/L) 1. 5 μL,菌株 HEW - B113 基 因組 DNA 50 ng。反應條件為 94 ℃預變性 5 min, 94 ℃ 變性40 s,54 ℃退火1 min,72 ℃ 延伸1 min 30 s,共30 個循環,72 ℃溫浴 10 min。反應結束 后取3 μL PCR 產物在 1. 5% 瓊脂糖凝膠上進行電 泳檢測。所得 PCR 產物回收純化,送中科院微生物 所進行 DNA 序列的測定。將所測得的序列與 GenBank 中的16S rDNA 序列進行 BLAST 分析比對,檢 索相似的序列和系統發育相關的物種,隨后用 MEGA 5. 0 軟件構建系統發育樹。 

1.2.2 活菌和芽孢計數方法 活菌計數方法參照飼用微生物制劑中枯草芽孢 桿菌的檢測 ( GB/T 26428———2010) 方法進行,將 培養完成的發酵液進行 10 倍倍比稀釋至合適的稀 釋度,取100 μL 稀釋樣液涂布平板,每個稀釋度 做3 個重復,以平板上出現 30 ~300 個菌落數的稀 釋度平板為計數標準進行活菌計數,根據稀釋倍數計 算發酵液的含菌量。取培養完成后的發酵液10 mL 于 試管中,置于85 ℃水浴鍋中恒溫 10 min 后,取出 冷卻,按照活菌計數方法測定處理后菌液中的細菌 總數,即為芽孢數。 1.2.3 種子液生長曲線的繪制 取活化后的 HEW - B113 轉接 NA 試管斜面, 接種完成后置 37 ℃恒溫培養 16 h。培養完成后, 取2 只試管斜面,分別加入 2 mL 無菌氯化鈉注射 液制備成枯草芽孢桿菌菌懸液。將枯草芽孢桿菌菌 懸液接種于 NA 液體培養基中,接種量 1%,搖瓶 裝液量100 mL/500 mL,接種完成后置于37 ℃恒溫 振蕩培養,搖床轉速為200 r/min,每隔1 h 取出2 mL 測其活菌總數,繪制生長曲線。 1.2.4 培養基單因素試驗 HEW - B113 培養基碳源、氮源和無機鹽的優 化采用單因素試驗。以基礎培養基為發酵培養基, 分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、乙 酸鈉和檸檬酸鈉等量替換葡萄糖,分別測定發酵液 中活菌數和芽孢數獲得最優碳源。然后以最優碳源 為碳源,無機鹽和培養條件不變,分別用硝酸鈉、 尿素、牛肉膏、酵母膏、氯化銨、豆粉、麩皮和硝 酸鉀等量替換蛋白胨,分別測定發酵液中活菌數和 芽孢數獲得最優氮源。在確定最優碳和氮源后,用 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸 鐵、硫酸亞鐵和硫酸鋅等量的培養基中的 MgSO4· 7H2O,分別測定發酵液中活菌數和芽孢數獲得最優 無機鹽。 1.2.5 培養基正交試驗 在單因素試驗的基礎上,確定了碳、氮源和無 機鹽,通過預試驗確定單因子的水平變化,因此以 檢測發酵液中芽孢數 ( CFU) 為指標,選定 A ( 玉 米淀粉,g/100 mL) ,B ( 葡萄糖,g/100 mL) ,C

(豆粉,g/100 mL),D (酵母膏,g/100 mL),E ( 硫 酸錳,g/100 mL) ,F ( 硫酸鐵,g/100 mL) 6 個因 素,設5 個水平進行正交試驗 ( 見表1) 。試驗重復3 次,檢測方法同上,將3 次結果的平均值作為試驗結 果,用SPSS 軟件分析獲得發酵最佳配方。

表1 HEW -B113 發酵培養基正交試驗

 

1.2.6 培養條件的優化 在確定發酵培養基成分后測定不同培養條件下 發酵液中的活菌數和芽孢數。以發酵液中活菌數和 芽孢數為指標分別對接種量、發酵搖瓶裝液量、轉 速、初始 pH、發酵溫度和發酵時間進行優化獲得 最優發酵條件。 

2 結果與分析 

2.1 菌株 HEW - B113 鑒定結果 通過對菌株HEW -B113 形態特征觀察 (見圖1), 試驗結果表明其在 NA 培養基上菌落呈污白色,菌落 不透明,表面水分較少且粗糙有褶皺,當液體靜止培 養時能形成皺醭; 通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察 發現,菌株 HEW - B113 為革蘭陽性桿菌,無莢膜, 周生鞭毛,具有運動性,能產生橢圓形芽孢。 通過生理生化鑒定獲得菌株 HEW - B113 的生理 生化特征,從表 2 可見: 菌株 HEW - B113 能耐受 7%NaCl,45 ℃下生長良好,4 ℃下不能生長,能利 用檸檬酸鹽,不能利用丙二酸鹽,V - P 為陽性,并 能利用多種糖醇產酸。生理生化與模式枯草芽孢桿 菌比較可以鑒定菌株 HEW -B113 為枯草芽孢桿菌。 

表2 菌株 HEW -B113 主要生理生化鑒定結果 


注: 表中“ND”表示未測定, “d”表示 11% ~ 89% 菌株為陽性, “- ”表示陰性,“+ ”表示陽性。

注: 從左到右依次為單菌落形態、細胞形態和革蘭染色形態HEW - B113

圖1 HEW - B113 菌株的形態特征 

利用細菌通用引物27F 和1492R 擴增獲得枯草 芽孢桿菌的 16S rDNA 片段,片段大小在 1 500 bp 左右 ( 見圖2) ,測序獲得菌株 HEW - B113 的 16S rDNA 序列,其長度為 1 419 bp。將獲得的序列用 MEGA5. 0 構建系統進化樹 ( 見圖3) 進行序列比較 分析,可以看出 HEW - B113 與枯草芽孢桿菌聚于 同一分支中,其同源性分別達到99%。通過菌株 HEW - B113 的形態特征、生理生化反應和分子特 征,鑒定菌株 HEW - B113 為枯草芽孢桿菌。登錄 號為 KF849801。

注: B HEW - B113,M DL2000 Marker。 

圖2 菌株 HEW - B113 16S rDNA PCR 擴增結果

圖3 菌株 HEW - B113 系統發育分析 

2.2 菌株 HEW - B113 的生長曲線 通過活菌計數繪制枯草芽孢桿菌 HEW - B113 的生長曲線 ( 見圖 4) ,當枯草芽孢桿菌 HEW -B13 剛接入培養基中的前1 h,菌體生長緩慢,一 直處于平穩狀態,到 1 h 時菌體開始增加,從 1 h 后菌體迅速呈對數生長,由此可以判定0 ~1 h 為延 滯期; 當菌體生長到 4 h 后由于培養基中成分基本 被利用,菌體的生長減慢,到 5 h 后菌體量基本不 再增加,由此可以判定 1 ~ 5 h 為枯草芽孢桿菌 HEW - B13 的對數生長期; 5 h 開始培養基中的菌 體量基本趨于平穩,到11 h 后培養基中菌體量開始 下降,由此可以判定 5 ~11 h 為穩定期,11 h 后枯 草芽孢桿菌 HEW - B13 的生長進入衰亡期。由生長 曲線可知1 ~5 h 為枯草芽孢桿菌 HEW - B13 的對 數生長期,在對數生長期內,菌體生長活性最強, 最適合做種子液,通過試驗時間考慮,我們選取 5 h時的發酵培養液作為下一步發酵培養的種子液。

圖4 枯草芽孢桿菌 HEW -B113 生長曲線

2.3 菌株 HEW - B113 發酵培養基單因素試驗結果 

2.3.1 碳源優化結果 通過48 h 發酵后,檢測各碳源對枯草芽孢桿菌 HEW - B113 活菌數和芽孢數的影響結果見圖4,可 見葡萄糖為最適碳源,其活菌數和芽孢數分別為25 億 CFU/mL 和 6. 8 億 CFU/mL,其次為玉米淀粉, 其活菌數和芽孢數分別為 23 億和 7. 5 億 CFU/mL。 考慮到實際生產應用選取玉米淀粉和葡萄糖復配作 為下一步研究的碳源,玉米淀粉和葡萄糖比例 為2∶1。 

2.3.2 氮源優化結果 通過48 h 發酵后,檢測各氮源對枯草芽孢桿菌 HEW -B113 活菌數和芽孢數的影響結果見圖5,從活 菌數看,豆粉為最適氮源,其活菌數和芽孢數分別為 47 億和27 億 CFU/mL; 從芽孢數看酵母膏為最適氮 源,其活菌數和芽孢數分別為45 億和36 億CFU/mL;從芽孢率看酵母膏為最適氮源,由營養成分組成及 成本看,選取豆粉和酵母膏為最適氮源,其分配比 例為3∶1。

圖4 枯草芽孢桿菌 HEW - B113 碳源篩選結果

圖5 枯草芽孢桿菌 HEW - B113 氮源篩選結果

2.3.3 無機鹽優化結果 通過48 h 發酵后,檢測各無機鹽對枯草芽孢桿 菌 HEW - B113 活菌數和芽孢數的影響結果見圖6, 硫酸錳為最適無機鹽,其活菌數和芽孢數分別為65 億和39 億 CFU/mL,其次為硫酸鐵,其活菌數和芽 孢數分別為 44 億和 32 億 CFU/mL??紤]到實際生 產應用選取硫酸鐵和硫酸錳復配作為下一步研究的 無機鹽,硫酸鐵和硫酸錳比例分別為1∶1。 

2.4 菌株 HEW - B113 發酵培養基正交試驗結果 通過48 h 發酵后,檢測各發酵液的枯草芽孢桿 菌 HEW - B113 芽孢數,結果見表 3,由表中 R 值 可知各因素對 B113 芽孢數的影響大小依次為 B > A > F > C > E > D,根據 k 值可確定各因素水平的最 佳組合為 A5B3C2D1E5F4,即玉米淀粉 2%、葡萄 糖1%、豆粉1%、硫酸錳02. %和硫酸鐵0. 15%。

表3 枯草芽孢桿菌 HEW - B113 培養基正交試驗結果

圖6 枯草芽孢桿菌 HEW -B113 無機鹽篩選結果 


2.5 菌株 HEW - B113 發酵條件試驗結果 確定最佳發酵培養基的成分之后,對發酵條件 進行逐一優化,獲得最優發酵條件。當初始 pH 7. 1、 接種量0. 8%、發酵搖瓶裝液量100 mL/500 mL、轉 速200 r/min、發酵溫度 35 ℃及發酵時間 40 h 時,菌株 HEW - B113 發酵液中的活菌及芽孢數最多, 因此將其作為最優發酵條件。

2.6 驗證性試驗 運用優化后的發酵條件進行驗證試驗,至少 3 次重復試驗,測發酵液中活菌數及芽孢數。結果均 比對照組高,且存在顯著性差異。由此可見驗證試 驗結果均高于正交試驗的各試驗組,并且重復性 好,說明該發酵條件是較優條件。 

3 討論 益生芽孢桿菌可產生脂肽、肽、磷脂、多烯、 氨基酸和核酸等多種抑菌物質,具有廣譜抑菌活 性,綠色無污染。目前芽孢桿菌類是研究比較廣泛 的一類防治疫病的微生物。已有很多研究表明,益 生芽孢桿菌可應用于畜牧養殖中,能夠頡頏病原微 生物、增強機體的免疫力及提高養殖的經濟效益。 研究從健康豬腸道中分離獲得一株芽孢桿菌 HEW - B113,通過細菌鑒定的方法 如形態學、生理生化和分子生物學法鑒定,最終確 定其為枯草芽孢桿菌,并對其發酵培養基成分及發 酵條件進行優化,最終獲得 HEW - B113 的最優發 酵培養基為玉米淀粉2%、葡萄糖 1%、豆粉 1%、 硫酸錳0. 2%和硫酸鐵 0. 15%; 最佳發酵條件為初 始 pH 7. 1、接種量 0. 8%、發酵搖瓶裝液量 100 mL/500 mL、轉速 200 r/min、發酵溫度 35 ℃及發 酵時間40 h。研究為優良益生菌的篩選提供了豐富 的菌株來源,為進行菌株的耐酸堿、耐膽鹽、益生 特性及安全性等研究奠定了基礎。

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2018年6月8日 14:43
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