一株乳酸菌培養條件優化及對 膽鹽和酸性環境耐受性的研究

尹望  杜志琳  李雪平 

(北京好實沃生物技術有限公司,北京 101399)

摘 要:對一株豬源乳酸菌 HEW - A208 的培養條件進行優化,并研究其對膽鹽及酸性環境的耐受性。 通過對菌落數、菌落大小和溶鈣圈大小3 項指標進行檢測,確定乳酸菌分離培養基為最優培養基; 在 pH 2. 5、3. 5 和4. 5 環境下處理150 min 對該菌無顯著影響,在 pH 1. 5 環境下處理 30 min 該菌仍保持較高的存 活率; 膽鹽對該菌生長有一定影響,但短時間內低質量分數處理影響較小。相同膽鹽質量分數下,培養時間 越長,活菌數越低,膽鹽質量分數高于0. 2%時該菌生長基本停滯。 

關鍵詞:乳酸菌; 豬源; 培養條件優化; 酸性環境; 膽鹽

  乳酸菌是一群廣泛存在于人畜腸道、禽腸道、 食品、物料及少數臨床樣品中,能夠分解糖產生大 量乳酸的革蘭陽性細菌的統稱。目前,乳酸菌已被 廣泛應用于食品、畜牧和工業等各個領域,其特殊 的生理活性和營養功能正日益引起人們的重視。乳 酸菌可以提高食品的營養價值,改善食品風味,提 高食品保藏性和附加值; 也可以用于飼料添加劑的 生產,乳酸菌能夠調節畜禽腸道內正常菌群和保持 微生態平衡,提高飼料轉化率,降低料肉比,同時 也提高了畜禽的抗病能力從而降低抗生素的用量; 乳酸菌用于微生態制劑,必須提高其對耐酸和耐膽 鹽的能力,HEW - A208 是從豬腸道中分離的乳酸 菌中產酸能力及抑菌能力最強的一株菌,研究該菌 對低 pH 和膽鹽的耐受性,旨在為豬源乳酸菌應用 于飼料添加劑提供理論依據。 

1 材料與方法 

1.1 菌株 

  北京好實沃生物技術有限公司實驗室保藏的一 株篩選自仔豬腸道的乳酸菌,在 MRS 培養基上常規培養。 

1.2 供試主要培養基和試劑 

   RJP 培養基: 牛肉膏 3、蛋白胨 3、酵母菌 3、 乳糖20 和瓊脂15 g/L,pH 6. 0。 

   MRS 固體培養基: 牛肉膏 10、酵母膏 5、葡萄 糖 20、無水乙酸鈉 5、檸檬酸氫二銨 2、MnSO4· H2O 0. 05、K2HPO4 2、MgSO4·7H2O 0. 2 和瓊脂粉 18 g/L,吐溫80 1 mL/L,pH 6. 8。 

    LAB 培養基 : 購自太鼎生物科技有限公司。 

    乳酸菌分離培養基: 牛肉膏10、蛋白胨10、酵 母膏10、葡萄糖10、CaCO3 20 和瓊脂15 g/L,番茄汁 20%、吐溫80 0. 05%和溴甲酚綠0. 01%,pH 6. 5。 

   改良馬鈴薯培養基: 馬鈴薯 200、蔗糖 2 和瓊 脂20 g,pH 自然 ( 約6. 0) 馬鈴薯去皮,切成塊加 水,煮沸30 min,用紗布過濾,濾液加糖,定容至 1 000 mL,裝入三角瓶。 

   LB 固體培養基 ( f) : 蛋白胨10、酵母粉5、氯 化鈉10 和瓊脂 10 g/L,豬膽鹽 ( 購至上?;瘜W試 劑公司,含膽酸60%以上) ,鹽酸,氯化鈉注射液。 

1.3 主要試驗儀器 

  JA2003 型電子天平 ( 上海舜宇恒平科學儀器 有限公司) ,HZC -250 型恒溫振蕩培養箱 ( 江蘇省太倉市試驗設備廠) ,LDZH - 200KBS 型立式壓力 蒸汽滅菌器 ( 上海申安醫療器械廠) 等。 

1.4 方法 

1.4.1 乳酸菌 A208 生長曲線繪制 

   將活化多次的 HEW - A208 以5% ( 體積/體積) 的接種量接入 MRS 液體培養基,瓶口用10 層紗布加 牛皮紙包住,置于恒溫搖床,180 r/min,37 ℃條件 下培養。0 ~18 h,每隔1 h 取一次樣,0 h 的樣作為 對照,于600 nm 處比色,測定發酵液的 OD 值。 

1.4.2 乳酸菌 HEW - A208 培養條件優化 

   取 HEW - A208 沙土管保藏的菌種經平板和斜 面多次活化,取菌液1 mL,用 0. 9%氯化鈉溶液進 行梯度稀釋,取10 -6、10 -7和 10 -83 種稀釋度,分 別接種于 6 種培養基中,取 1 mL 不同稀釋度的菌 液,用傾注法與培養基混合均勻,培養基凝固后置 于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h,進行菌落計 數。每天1 次,并用刻度尺在放大鏡下測量菌落及 溶鈣圈的直徑。 

1.4.3 乳酸菌 A208 膽鹽耐受性檢測 

   試驗選用 4 個膽鹽質量分數處理,0. 1%、 0. 2%、0. 3%和0. 4% ( 質量/體積) ,不加膽鹽組 作為對照組。將活化好的乳酸菌 A208 按 5% ( 體 積/體積) 的接種量接種于上述各試驗組,培養基 選用液體 MRS 培養基,37 ℃恒溫搖床180 r/min 培 養。于接種后的 1、2、3、4 和 5 h 取樣測定活菌 數,平板計數采用固體 MRS 培養基傾注法,37 ℃ 常規培養。 

1.4.4 乳酸菌 A208 低 pH 耐受性檢測 

   試驗選用4 個不同 pH 處理,用1 mol/L 鹽酸調 節 MRS 液體培養基至 pH 1. 5、2. 5、3. 5 和4. 5,接 種量、接種方法與培養方法同上。于接種后的 0、 30、60、90、120 和150 min 取樣測定活菌數,平板 計數采用固體 MRS 培養基傾注法,37 ℃常規培養。 

2 結果與分析 

2.1 乳酸菌 A208 的生長特性測定 

  從圖1可見: A208在接種后1 ~ 2 h生長較緩慢,3 h 后進入對數生長期,8 h 后 OD 值趨于穩 定,進入穩定期。 


圖1 乳酸菌 A208 生長曲線

2.2 乳酸菌 A208 培養條件優化結果 

   從表1 可見: 在這6種常見培養基中,乳酸菌 A208 在乳酸菌分離培養基中生長最佳。第4天的 活菌數達 4.41 億 CFU/mL,菌落直徑達 0.48 cm, 溶鈣圈直徑1.11 cm。A208 生長最差的是 LAB 培養 基,第6天活菌數僅為 0.449 億 CFU/mL,菌落直 徑為0.12 cm。 

表1 不同培養基中 A208 的生長情況



2.3 不同 pH 環境對乳酸菌 A208 生長的影響 

   從表2 可見: pH 2. 5、3. 5 和4. 5 對 A208 的生 長無太大影響,在 pH 4. 5 時,活菌數隨時間的延 長而不斷上升,菌株生長良好; 在 pH 3. 5 時,整 個處理時間段內,活菌數基本保持不變,說明 pH 3. 5 和4. 5 對 A208 的存活無明顯抑制作用; 在 pH 2. 5 時,隨時間延長,活菌數有所下降,但最后活 菌數仍然較高; 在 pH 1. 5 時,處理時間到 60 min 以上時,活菌數低于 1 萬 CFU/mL,說明 A208 對 pH 1. 5 的耐受性差。

表2 不同 pH 環境對乳酸菌 A208 的生長影響 CFU/mL 


2.4 膽鹽對乳酸菌 A208 存活的影響 

   從表3 可見: 與對照相比,總體上 A208 的生 長受到膽鹽的抑制,隨著培養時間的延長,活菌數 下降,且在處理時間相同的條件下,膽鹽質量分數 越高,A208 活菌數越低。其中,A208 對 0. 1% 膽 鹽耐受性最強,在 0. 2% 和 0. 3% 膽鹽質量分數條 件下,耐受性較差; 0. 4%膽鹽質量分數下 A208 生 長更差。

表3 不同膽鹽質量濃度下 A208 的活菌數 CFU/mL


3 討論與結論 

   研究通過比較 A208 在不同固體培養基中的生 長情況,篩選出了最適合其生長的固體培養基,即 乳酸菌分離培養基。 

   益生菌是以口服的方式進入動物消化道內,因 此必須保證所選用的菌株具有抵抗較低 pH 的能力, 才能有效的發揮作用。乳酸菌是腸道中常見的內源 性細菌,畜禽食用乳酸菌后,可以改變腸道內環境, 抑制有害菌的繁殖,調節腸道菌群平衡。乳酸菌通 過黏菌素與腸黏膜細胞緊密結合,能夠修復腸道菌 群屏障,防治腸道疾病。作為益生菌中常用的菌種, 乳酸菌代謝過程中本身產乳酸,可適應較低的 pH 環 境,一般都能夠抵抗較低 pH 環境。試驗室篩選的 A208 能夠耐受 pH 1. 5 的酸性環境,且存活率較高。 仔豬出生時胃液pH 在5 ~6,數小時后會降到4 左右, 2 月齡后在3 以下,成年豬的最低 pH 可達到1. 5。因 此,A208 的耐酸能力達到了要求。 

   作為益生菌,除了具備上述耐受低 pH 環境的 能力外,還必須能夠耐受小腸中膽鹽等形成的高滲 透壓環境。目前,一些乳酸菌具備一定的膽鹽耐受 能力。實驗室篩選的乳酸菌 A208 在 0. 1 % 膽鹽質 量分數下存活率相當可觀。 

   益生菌除了能耐受酸性環境和高質量分數膽鹽的能力外,還需具備在腸道中快速繁殖的能力。生 長速度快的益生菌株能夠成為腸道中的優勢菌群, 能夠發揮其益生作用。因此,研究 A208 的生長曲 線,發現其在 3 h 后迅速進入對數生長期,在 8 ~ 10 h 左右菌量達到最高,說明它具有在腸道中快速 繁殖的能力。 

   綜上所述,乳酸菌 A208 具有生長繁殖速度快, 耐受較低 pH 和膽鹽環境的能力,是一株優良的菌 株,有進一步研究的價值。

參考文獻

[1]趙紅霞,詹勇,許梓榮. 乳酸菌的研究及其應用 [ J] . 江西飼料,2003(1) :9 -11. 

[2]吳惠芬,毛勝勇,姚文,等. 2 株豬源乳酸菌對低 pH 和膽鹽耐受性及熱穩定性研究[ J] . 華中農業 大學學報,2005, 24(3) :265 -268. 

[3]Ruas - Madiedo P,Hugenholtz J,Zoon P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[ J]. International Dairy Journal,2002(12) :163 -171. 

[4]劉巖巖,張鷺,張春艷,等. 一株乳酸菌培養條件優 化及菌種鑒定[ J] . 齊齊哈爾大學學報,2008(2) : 21 -24. 


5]諸葛健,王正祥. 工業微生物試驗技術手冊[ M] . 北 京:中國輕工業出版社,1994:109 -112. 

[6]顧瑞霞,譚東興,郭久和,等. 膽汁酸鹽和低 pH 對 乳酸菌活性的影響[ J] . 微生物學通報,1996,23 (3) :144 -146.

[7]凌代文,東秀珠. 乳酸細菌分類鑒定及試驗方法 [ M] . 北京:中國輕工業出版社,1999:6 -38.






2018年6月8日 14:43
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