丁酸梭菌C-101益生性及抗逆性研究

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好實沃生物,北京101399

摘要:本研究以一株丁酸梭菌C-101作為實驗菌株,從抑菌能力,耐熱性,耐人工胃液,人工腸液,人工膽鹽能力幾個方面,分析了其作為微生態制劑菌種的潛力,實驗結果可知,該菌株耐熱性良好,80攝氏度處理5min,存活率仍達到99.0%,人工胃液處理2h,存活率87.8%,人工腸液處理2.5h,存活率98.9%,0.4%膽鹽處理,生長情況良好,能夠抑制常見的致病菌:大腸桿菌,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌,單增李斯特菌,益生性能優良,可以作為微生態菌劑開發菌種。

關鍵詞:微生態制劑,益生性,抗逆性

Study on the  probiotic and resistance of Clostridium butyrate C-101

Zhang nan, Li Xue-Ping

 Heswof Biotechnology  Beijing 101399, China

In this research, a Clostridium butyrate C-101 was used as an experimental strain. Several aspects, including antibacterial ability, heat resistance, resistance to artificial gastric fluid, artificial intestinal fluid, artificial bile salt, were studied  to analyzed the potential of it as a microecological agent.  The results showed that: the strain had a good a outstanding capacity of heat resistance, treated of 5min at 80 degrees, its survival rate  reached 99.0 %,  disposed in artificial gastric juice for 2H, survival rate 87.8 %, artificial intestinal fluid treatment 2.5 H, survival rate 98.9 %, treatment in 0.4 % bile salt , it could inhibit common pathogenic bacteria: E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria Monocytogenes, and be used as microecological fungicide development species.

Keyword: microecological preparation, probiotic, resistance

       丁酸梭菌(Clostridium butyricum)屬于厭氧革蘭氏陽性菌,電子顯微鏡下觀察其菌體形態呈直或略有彎曲的桿狀,單個或成對,部分呈絲狀,短鏈,白色略帶灰感,細菌直 徑為(0.6~1.4)×(2.7~7.3)μm,菌體中間略飽滿,兩端呈 鈍圓形,周身有鞭毛,具運動性[1],廣泛存在于奶酪、天然酸奶、酒窖泥、土壤及人與動物糞便中[2]。丁酸梭菌代謝過程中主要產物為丁酸,在反芻動物腸道中,丁酸能夠被結腸上皮細胞代謝利用并產生能量。做為產芽孢菌,丁酸梭菌具有耐熱、耐酸、耐多種抗生素等能力[3],可調節動物腸道內的微生態平衡,具有調整腸道功能的作用。丁酸梭菌還具有抗癌、提高機體免疫力、抗氧化等作用,目前已被制成微生態制劑廣泛地用于保健食品[4]。

2009丁酸梭菌被農業部批準,允許作為活菌制劑在飼料中添加。微生態制劑能否作為活菌制劑被應用,取決于菌種的益生性能,以及其在后續加工過程中的抗逆性,能夠保證微生態制劑有效活菌數及產品的穩定性。丁酸梭菌作為一種梭狀芽孢桿菌,具有一定耐高溫、耐動物胃腸道環境的能力,但是這些特性在不同菌株之間存在較大的差異。所以,研究丁酸梭菌的益生性能及抗逆性顯得尤為重要,本研究中,以實驗室篩選得到的一株丁酸梭菌C-101為實驗菌株,研究了其高溫耐受能力,抑菌能力,耐胃酸,耐膽鹽能力,為該菌株的應用提供了理論基礎。

1. 實驗材料與方法

1.1菌株

       丁酸梭菌C-101:由北京好實沃生物技術有限公司保藏提供。

指示菌:大腸埃希氏菌(Escherichiacol),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),單核細胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,腸炎沙門氏菌(S. enteritidis)。

1.2實驗材料

       強化梭菌培養基(reinforced clostridial medium,RCM)、LB瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)培養基。

種子培養基:RCM液體培養基。

丁酸梭菌發酵培養基:蛋白胨 10.0 g,牛肉粉 10.0 g,酵母粉3.0 g,葡萄糖5.0 g,可溶性淀粉1.0 g,L-半胱氨酸鹽粉 3.0 g,磷酸氫二鉀 0.05 g,硫酸鎂0.08 g,硫酸錳0.002 g,純化水1000 mL,pH 7.0[5]。

以上培養基制備完成后均需高壓滅菌備用,滅菌溫度121℃,滅菌時20min。

人工胃液,人工腸液的配制參照《中國藥典》。

1.3 實驗方法

1.3.1抑菌能力實驗

       菌種準備:將甘油管保藏的丁酸梭菌C-101 0.1 mL接種到10 mL液體RCM培養基中,厭氧培養18 h,備用。將活化好的菌株接種于種子培養基,厭氧培養24 h,再按5%接種量,接種于發酵培養基,37℃厭氧培養48h后備用。

將大腸桿菌、沙門氏菌劃線接種于LB固體培養基上37 ℃培養24 h, 依次用無菌生理鹽水洗脫菌體,制備菌懸液,并將菌懸液的菌濃度稀釋為106CFU/mL,備用。

將金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌接種于TSA固體培養基上,于37 ℃條件下培養24 h,依次用生理鹽水洗脫,制備菌濃度為106CFU/mL左右的菌懸液后,備用。

指示菌平板的制備:采用雙層平板法制備指示菌平板。取15 mL培養基加入到培養皿,凝固后作為下層;取5 mL含2%不同指示菌菌懸液的培養基加入凝固后的下層培養基上作為上層,待用。

采用牛津杯法測定抑菌活性。在牛津杯中加入200 μL丁酸梭菌發酵上清液,于37 ℃條件下 培養16~18 h,觀察并測量抑菌圈直徑。每組測定兩個重復。

1.3.2 菌懸液的制備

       將活化好的菌株C-101種至種子培養基中,37 ℃厭氧培養24 h后,按5%接種量接種至發酵培養基,37 ℃厭氧培養48 h,發酵培養結束后,3 000 r/min離心10 min,收集菌體,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌兩次后重懸,使菌體濃度為4.5×108CFU/mL,備用。

1.3.3耐熱性試驗

       取上述菌液樣品1 mL到含9 mL甘油溶液(80%甘油)的試管中,充分混勻,分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、 90 ℃、100 ℃的水浴中處理5 min,置于0 ℃冰水混合物中冷卻,3000 r/min離心10 min,收集菌體,PBS洗滌兩次后重懸,采用梯度稀釋平板法測定其活菌數,每個樣品重復3次,計算存活率,其計算公式如下:

存活率=處理后活菌數/處理前活菌數×100%

1.3.4人工胃液耐受性試驗

       取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工胃液中,人工胃液最終pH值調為1.5左右,振蕩混勻,37 ℃水浴,每隔0.5 h取樣,將經過人工胃液處理后的菌懸液,3000 r/min離心10 min,PBS洗滌兩次后重懸,梯度稀釋法進行計數,每個樣品3個平行,計算存活率。

1.3.5人工腸液耐受性試驗

       取上述樣品菌液1 mL到9 mL人工腸液中振蕩混勻, 37 ℃水浴2.5 h,毎隔0.5 h取樣,3 000 r/min離心10 min, PBS緩沖液洗滌兩次后重懸,采用梯度稀釋法進行活菌計數,每個樣品3個平行,計算存活率。

1.3.6膽鹽耐受性試驗

       在RCM液體培養基中加入不同濃度的豬膽鹽,使其濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%,混勻,121 ℃、 15 min滅菌后備用。按107 CFU/mL接種量分別接種丁酸梭菌C-101,厭氧培養24 h,檢測活菌數,每個樣品重復3次。

2. 實驗結果與討論

2.1 抑菌實驗

      丁酸梭菌代謝產生的有機酸能夠降低腸道pH,同時產生細菌素,抑制腸道中致病菌的生長,丁酸梭菌對常見致病菌抑制能力結果如表1所示,結果顯示,丁酸梭菌C-101對常見致病菌具有顯著抑制能力,由于其產生的抑菌物質非單一有機物,所以,其抑菌物質仍待進一步的研究。

表1 C-101對常見致病菌抑菌效果

指示菌

大腸桿菌

金黃色葡萄球菌

沙門氏菌

單增李斯特菌

抑菌圈直徑/mm

17.01

15.21

17.02

11.36

2.2 耐熱性實驗

由表2可知,丁酸梭菌C-101具有良好的耐熱性,80攝氏度處理5min后,存活率仍可達99.5%,溫度繼續升高,存活率下降,對于飼料加工過程,需縮短熱處理時間。

 

表2 C-101耐熱性能

實驗組

熱處理溫度

對照

50

60

70

80

90

100

活菌數×107cfu/ml

4.5

4.48

4.48

4.48

4.45

3.35

2.20

存活率%

100

99.5

99.5

99.5

99.0

74.4

48.9

2.3人工胃液耐受性

表3 C-101人工胃酸耐受性

實驗組

處理時間h

對照

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

活菌數×107cfu/ml

4.50

4.50

4.41

4.01

3.95

3.90

存活率%

100

100

98.0

89.1

87.8

86.7

動物胃液為酸性,pH一般在2.5-3.0[6],微生態制劑能否達到腸道發揮效應,需經過胃液,并保持一定的活性,由表3可知,丁酸梭菌經人工胃液處理后2.5h后活菌數仍能夠保持較高水平,活性降低13.3%,性狀優良,可以作為微生態制劑生產用菌種。

2.4人工腸液耐受性

表4 C-101人工腸液耐受性

實驗組

處理時間h

對照

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

活菌數×107cfu/ml

4.50

4.50

4.50

4.50

4.45

4.45

存活率%

100

100

100

100

98.9

98.9

由表4可知,丁酸梭菌C-101對人工腸液具有很好的耐受性,人工腸液處理2.5 h,活菌數均為 4.45×108 CFU/mL,存活率98.9%,說明該菌株在腸道內保持較高的存活率。

2.5 膽鹽耐受性

微信圖片_20191113101547.png

 

圖1 C-101膽鹽耐受性

動物腸道內膽鹽的質量分數約為0.03%-0.30%,菌株能否在腸道中定植,取決于菌株對膽鹽的耐受能力[7]。由圖1可知,菌株C-101對膽鹽具有很好的耐受性,在人工膽鹽濃度0.4%條件下能夠正常生長,當膽鹽濃度達到0.5%時受到抑制,可以保證其順利地通過小腸,并最終成功定殖于動物腸道后端。

3. 結論

本研究以實驗室分離保藏的一株丁酸梭菌C-101為實驗菌株,對其抑菌能力,耐熱性,人工胃液,人工腸液,人工膽鹽耐受性,實驗結果顯示,該菌株對常見致病菌由顯著的抑制效果,耐熱性良好,能夠耐受飼料制?;蚣庸み^程的熱處理過程,對胃酸,腸液,膽鹽耐受性能優良,具有良好的應用潛力。 

參考文獻

[1] 趙建新,張灝,田豐偉. 丁酸菌的分離、鑒定及篩選[J]. 食品與生物 技術學報,2002(6):597-601,612.

[2] 桂國弘,徐娥,楊華,等.丁酸梭菌調節腸道健康的作用機制 [J]. 飼料研究,2016( 22) : 42-46.

[3] 田召芳,李春蕾,黨安坤. 丁酸梭菌作用機理與研究進展[J]. 中國畜禽種業,2017( 8) : 36-38.

[4] 熊祖明,袁杰利. 酪酸梭菌的研究與應用進展[J]. 中國微生態學雜志,2011,23( 12) : 1143-1145.

[5] 謝麗靜,王麗,王偉華等,丁酸梭菌優良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究[J],中國釀造,2018,37(6):91-96

[6] 陳桂芳,劉艷,單春喬,等. 費氏丙酸桿菌生物學特性及與5株益生菌拮抗性試驗研究[J]. 中國釀造,2018,37(1):69-73.

[7] 張媛媛. 復合芽孢桿菌制劑發酵工藝及其耐受性研究[D]. 哈爾濱:東北林業大學,2012.

 

2019年11月13日 11:20
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